【導(dǎo)讀】 面對眾多的污染源，比如樣本交叉污染、試劑儀器交叉污染、克隆質(zhì)粒污染、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染、還有極容易忽視的氣溶膠污染，氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點(diǎn)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系，在空氣與液體面摩擦?xí)r，比如在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。

你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果受到污染的影響了嗎？

生物實(shí)驗(yàn)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測都是微觀的，基于細(xì)胞，分子，蛋白水平，而這些微觀樣本對外界環(huán)境的影響敏感，比如溫度、ph值、酶解、損傷等，在我們盡力呵護(hù)樣本的生存環(huán)境的同時(shí)，污染也是需要注意的頭等大事，要堅(jiān)決避免環(huán)境中的“雜質(zhì)”的亂入，包括樣本污染，試劑儀器交叉污染、產(chǎn)物氣溶膠污染等對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。“易查不易察”，污染來的悄無聲息，防不勝防，假陽性結(jié)果讓無數(shù)生物學(xué)子抓狂和崩潰。

 

祿米今天就來扒一扒生物實(shí)驗(yàn)室污染之PCR實(shí)驗(yàn)污染你不知道的事

在眾多的生物實(shí)驗(yàn)室，分子生物學(xué)檢測方法如PCR因其高靈敏度、快速、操作方便等優(yōu)勢已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，不過正是由于它靈敏度極高，極微量的污染源都有可能導(dǎo)致檢測結(jié)果的假陽性，所以對環(huán)境污染的控制也極為嚴(yán)格。面對眾多的污染源，比如樣本交叉污染、試劑儀器交叉污染、克隆質(zhì)粒污染、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染、還有極容易忽視的氣溶膠污染，氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點(diǎn)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系，在空氣與液體面摩擦?xí)r，比如在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆�？珊�48000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)非常重要而被忽視的污染源。

雖然這些污染對PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響已經(jīng)受到了廣泛重視，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對污染控制都采取了各種辦法，比如定期大掃除清理、劃分操作區(qū)域、試劑分裝、操作謹(jǐn)慎、重復(fù)實(shí)驗(yàn)、多角度驗(yàn)證結(jié)果。但是微量的核酸片段就能被擴(kuò)增，所以對污染物的控制不僅僅是做到這些就能夠杜絕和避免的，關(guān)鍵是需要從源頭控制。目前多數(shù)生物試驗(yàn)室，分子實(shí)驗(yàn)每天都在大規(guī)模進(jìn)行，污染源已經(jīng)無處不在，特異性的，非特異性的，同源的，非同源的，廣泛分布在樣本容器、實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面，試劑溶液中、儀器表面內(nèi)管附著等等，你以為普通的清理就能解決這些污染源嗎？必須是不行的，實(shí)驗(yàn)室大拿們都為了清除這些污染源研究出好多種方法，整理跟大家共享。

  常見的防止污染的方法，推薦給大家

合理的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)用品，包括移液器等應(yīng)專用。如有可能，應(yīng)在裝有紫外燈的層流式工作臺(tái)（如生物安全柜、超凈工作臺(tái)）內(nèi)，吸加PCR試劑，工作臺(tái)內(nèi)應(yīng)放置PCR*用的微量離心機(jī)、一次性手套、各量程的移液器和其他必須物品。

 

 

正確的實(shí)驗(yàn)操作

1. 吸加PCR試劑和模板的操作應(yīng)嚴(yán)格按要求進(jìn)行，吸樣要慢，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

2. 實(shí)驗(yàn)的過程中應(yīng)勤換手套，在進(jìn)出不同區(qū)域或進(jìn)行模板操作后，都應(yīng)及時(shí)更換手套。

3. 裝有PCR試劑的微量離心管在打開之前應(yīng)先做瞬時(shí)離心（約10s），將管壁及管蓋上的液體甩至管底部，從而減少污染手套或加樣器的機(jī)會(huì)。開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠，造成污染。

4. 在同時(shí)進(jìn)行多個(gè)PCR反應(yīng)時(shí)，應(yīng)制備主反應(yīng)混合液，再分裝至PCR反應(yīng)管，*后添加樣品核酸模板，以減少單個(gè)添加操作繁瑣造成的污染。

 

實(shí)驗(yàn)器具和試劑

1. 實(shí)驗(yàn)室自己配置的試劑，如去離子水、緩沖液等，在使用之前均應(yīng)高壓滅菌或過濾除菌。

2. 分裝PCR試劑：所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，以減少重復(fù)取樣次數(shù)，并置于-20℃保存，適當(dāng)時(shí)，*好做到專人專用。另外，PCR試劑、PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或冰箱。

3. 所有吸頭、反應(yīng)管等應(yīng)一次性使用，使用之前，都應(yīng)經(jīng)過高壓處理。若條件允許，*好使用帶濾器的槍頭。各工作區(qū)內(nèi)的移液器要有標(biāo)識(shí)，應(yīng)固定使用用途，不能交叉使用。

 

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的相關(guān)規(guī)定，實(shí)驗(yàn)中至少應(yīng)：

1. 設(shè)置目標(biāo)DNA陽性對照反應(yīng)。對靶序列所作的適當(dāng)?shù)南♂尮ぷ鲬?yīng)于實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)別的位置進(jìn)行，這樣可防止將靶DNA的濃溶液帶到實(shí)驗(yàn)室中專門進(jìn)行PCR的位置。

2. 設(shè)置PCR試劑陰性對照和目標(biāo)DNA陰性對照反應(yīng)。